Antimikrobiální rezistence

Genetické řešení antimikrobiální rezistence

Od objevení penicilinu v roce 1928 se antibiotika používají k léčbě bakteriálních infekcí u lidí a zvířat. Od padesátých let byla antibiotika přidávána do konvenčních diet ke zlepšení růstu prasat a drůbeže. Vzhledem k vývoji a šíření bakterií rezistentních vůči antibiotikům však byla zakázána krmná antibiotika v Evropské unii a v dalších zemích produkujících prasata, např. v USA a Číně, jsou antibiotika postupně vyřazována. Některé bakterie jsou rezistentní vůči jednomu druhu antibiotik a jiné jsou rezistentní vůči vícero druhům, což představuje vážné celosvětové zdravotní riziko. 

Antimikrobiální rezistence (AMR)

Pro zajištění optimální účinnosti antibiotik při léčbě bakteriálních infekcí u lidí a zvířat roste celosvětový zájem o antimikrobiální rezistenci, kterou lze definovat jako schopnost bakterií odolávat účinkům antimikrobiálních látek (např. antibiotik).

Antimikrobiální rezistentní geny v bakteriích mohou být zděděny dělením nebo přeneseny přes plazmidy, malé molekuly DNA, které jsou nezávislé na chromozomální DNA. Plazmidy často nesou informace, které mohou prospět k přežití bakterií díky rezistenci k antibiotikům produkovaným samotnými bakteriemi nebo jinými organizmy v jejich prostředí. Například analýza izolátu E. coli rezistentního na kolistin, provedená čínskými vědci, odhalila plazmid s 19 geny rezistence k antibiotikům.

Pokud se po delší dobu antibiotika nepoužívají, hladiny rezistence u bakterií se snižují, ale při opětovném užívání antibiotik se mohou opět zvýšit. V chovu prasat existuje naléhavá potřeba najít nové alternativy pro antibiotika přidávaná do krmiva. Použití biotechnologií, zejména nových technik genových editací, může být takovou alternativou.

Bakterie získávají nové geny přirozeně

Mnoho důkazů naznačuje, že bakterie přirozeně získávají nové geny (včetně genů rezistentních vůči antimikrobiálním látkám), aby přežily v novém prostředí nebo hostiteli. Antimikrobiální rezistentní geny produkují enzymy pro zničení nebo inaktivaci antibiotik (viz schéma 1). Například bakterie rezistentní na penicilin (Staphylococcus aureus a E. coli) syntetizují β-laktamázu, která štěpí p-laktamový kruh penicilinu na neaktivní látku. Prostřednictvím tohoto mechanismu nemohou být bakterie zabity penicilinem, což vede k AMR. 

Schéma 1. Mechanismy zodpovědné za rozvoj antimikrobiální rezistence u bakterií (Znaménko X označuje neschopnost zabít bakterie).

Editace genů

V současnosti jsou vyvíjeny nové genové (genomové) editační postupy, které používají umělou nukleázu jako molekulární nůžky k vytvoření dvojitého řetězce v DNA na požadovaném genomovém lokusu. Prvním nástrojem pro přesnou editaci genů byla nukleáza označovaná jako zinkový prst ZFN (z angl. Zinc Finger Nuclease), po ní následovalo objevení návrhářské nukleázy TALEN (z angl. Transcription Activator-Like Effector Nuclease) a v posledních letech získává popularitu systém CRISPR (z angl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) jako konstruktivní nukleáza k přesnému střihu DNA v určitém bodě.

Mnoho laboratoří zaznamenalo úspěch s úpravou genů prasat, která mohou potenciálně sloužit jako dárci orgánů, modely nemocí, bioreaktory, mohou inaktivovat prasečí endogenní retroviry nebo zakládat genetické linie se zvýšenou užitkovostí a odolností vůči nemocem. V současné době se výzkum genově editovaných prasat zaměřuje na využití živin, odolnost proti chorobám a biomedicínské aplikace, jako je xenotransplantace orgánů bez hyperakutního odmítnutí.

CRISPR versus AMR

Systém CRISPR-Cas9 se skládá ze dvou složek, endonukleázy Cas9 a vodící RNA, která může být navržena tak, aby nasměrovala Cas9 ke štěpení DNA na prakticky libovolném lokusu genomu. CRISPR má schopnost selektivně cílit na specifické sekvence DNA a tudíž snadno rozlišovat mezi patogenními nebo komensálními bakteriálními druhy a lze ho s úspěchem použít pro zabíjení bakterií rezistentních k antibiotikům.

Pro zavedení systému CRISPR do bakterií jsou používány bakteriofágy, které jsou obecně bezpečné pro zvířata a lidi. Bakteriofágy bez vlastní DNA dostanou navrženou DNA, která kóduje vodící RNA a Cas9 a pak se transfekují do bakterií rezistentních vůči antibiotikům, kde Cas9, veden vodící RNA, štěpí bakteriální DNA na specifických místech, čímž se bakterie samy zničí (viz schéma 2).

Schéma 2. Principy ničení nežádoucích bakterií systémem CRISPR. 

K transportu CRISPR-Cas do bakterií jsou používány bakteriofágy. Navržená DNA kóduje vodící RNA a Cas9 nebo Cas3 pro řezání bakteriálních molekul DNA na více místech, což způsobí vlastní destrukci bakterií. Alternativně může být systém CRISPR-Cas9 využit k vyřazení genů zodpovědných za antimikrobiální rezistenci a k opětovné senzibilizaci rezistentních bakterií, takže budou usmrceny antibiotiky.

Podobně byl použit systém CRISPR-Cas3, který byl dodán přes bakteriofágy do Gram pozitivních a negativních bakterií, ve kterých rozštěpil molekuly DNA, čímž se řídila programovaná buněčná smrt. V jiné studii byl použit systém CRISPR-Cas9 k vyřazení genů zodpovědných za AMR, což vede k opětovné senzibilizaci rezistentních bakterií, takže jsou zabity antibiotiky. V další studii byl použit systém CRISPR-Cas9, který byl konstruován jako interferenční (CRISPRi), pro zabránění transkripčnímu mechanismu bakterií v přístupu k cílovému genu rezistence, čímž se umlčí jeho exprese a bakterie ztratí odolnost vůči antibiotikům. Přehled využití systému CRISPR je uveden v tabulce.

Využití systému CRISPR jako alternativy k antibiotikům.

Systém	Vektor	Cílový gen	Bakterie rezistentní k antibiotikům
CRISPR-Cas9	Bakteriofágy	Vícenásobná místa DNA (sebezničení)	Clostridium difficile
CRISPR-Cas3	Bakteriofágy	Vícenásobná místa DNA (sebezničení)	Gram pozitivní a negativní bakterie
CRISPR-Cas9	Plazmidy	Rezistentní geny vůči antibiotikům (knock out)	Escherichia coli
CRISPR-Cas9	CRISPRi plazmidy	Rezistentní geny vůči antibiotikům a membránové proteiny (umlčení exprese genu)	Staphylococcus aureus další Gram pozitivní bakterie

Technologie CRISPR umožňuje zabíjet bakterie a odstraňovat enzymy z bakterií, včetně bakterií rezistentních na antimikrobiální látky, v gastrointestinálním traktu zvířat. Praktickým dopadem této technologie by mělo být zmírnění AMR a vývoj alternativ k antibiotikům v krmivu prasat. Očekává se, že postupy genetického inženýrství spolu s fermentací krmiv a přípravou antimikrobiálních peptidů z krmných proteinů maximalizují účinnost využití živin a udržitelnost prasečího průmyslu na celém světě.

© 2019