Kančí sperma
Kvalitní sperma zvyšuje zisk
Umělá inseminace je preferovanou metodou reprodukce ve většině systémů intenzivního chovu prasat po celém světě. Ve srovnání s přirozeným pářením snižuje inseminace riziko přenosu chorob, umožňuje rozšíření vynikajících genů do stád prasnic a vede k lepší ziskovosti každého chovného kance. Pro ziskovou produkci inseminačních dávek je nutné získat od každého kance maximální množství vysoce kvalitních spermií. Tento příspěvek shrnuje současné poznatky o faktorech, které ovlivňují kvalitu a kvantitu kančího spermatu.
Faktory ovlivňující sperma
Kromě správného ošetřování kanců je třeba také správné zacházení se spermatem, aby nedošlo k poškození spermií. Stále více inseminačních stanic má systémy kontroly kvality, ve kterých je sledován každý krok od odběru po balení spermatu. Je známo, že teplota ředění a skladování nebo různé složení ředidel ovlivňují kvalitu spermatu. Stejně tak bakteriální kontaminace je nejkritičtější problém při jeho zpracování. Znepokojující je nejen negativní účinek bakterií na životaschopnost spermií, ale také nárůst jejich rezistence na antibiotika. V posledních letech byly zkoumány různé faktory, které mají vliv na kvalitu spermatu během manipulace s ním a jsou shrnuty v tabulce 1.
Tabulka 1. Faktory působící na kvalitu spermatu během manipulace
| Faktor | Podrobnosti | Co způsobuje |
| odběr spermatu | latexové rukavice | toxický pro spermie |
| tekutina ve sběrné nádobě | zvyšuje bakteriospermii | |
| odběr delší než 7 minut | zvyšuje bakteriospermii | |
| teplota ředění | konečné ředění při 22 °C vs. 30 °C (dvoufázové ředění) | po 3 dnech skladování nebyly pozorovány žádné rozdíly v pohyblivosti spermií, morfologii nebo integritě akrozomu |
| konečné ředění při 20 °C vs. 32 °C (dvoufázové ředění) | žádné rozdíly v integritě membrány nebo schopnosti reagovat na kondenzační podmínky | |
| konečné ředění při 21 °C vs. 32 °C (dvoufázové ředění) | nižší pohyblivost, zvýšené poškození membrány po 6 dnech skladování | |
| poměr ředění | 0,5x109 spermií /80 ml vs. 2,5x109 /80 ml | nižší pohyblivost |
| ředidla | krátkodobá vs. dlouhodobá | nižší pohyblivost po 4 dnech skladování |
| magnetizovaná | zlepšení integrity membrány | |
| antibiotika | zabránění růstu bakterií | |
| balení | sáčky vs. dutinky | k dosažení 17 °C méně času |
| některé plasty | jedovaté pro spermie | |
| teplota skladování | <12 °C | snížená pohyblivost a vitalita spermií |
| délka skladování | >4 dny | snížená pohyblivost a plodnost spermií |
| kontakt se vzduchem | během skladování | zvýšení pH, snížená pohyblivost spermií |
| otáčení dávek | 180° rotace/12 h nebo pět 360° rotací/h vs. žádná rotace | zvýšení pH, snížená pohyblivost spermií |
Odběr spermatu kanců se na inseminačních stanicích obvykle provádí manuální technikou s rukavicí. Je třeba mít na paměti, že některé rukavice (např. latexové) mohou být toxické pro spermie. Sběrná nádoba se používá předehřátá (38 °C), jelikož rychlé ochlazení způsobuje poškození spermií. Odběr spermatu je navíc nejkritičtější bod z hlediska bakteriální kontaminace. První část ejakulátu (cca 25 ml) se neodebírá, protože neobsahuje spermie a může mít vysoký počet bakterií. Následně se odebere frakce bohatá na spermie (40–100 ml), která obsahuje 80–90 % všech buněk spermií v ejakulátu. Zbytek ejakulátu je čirá, vodnatá tekutina, kterou není třeba odebírat, protože obsahuje málo spermií a je to hlavně sekrece vezikulárních žláz, prostaty a ke konci ejakulace bulbourethrálních žláz.
 |
| Systém pro analýzu spermatu (foto Maite Santonja) |
Ředicí postupy
Po ejakulaci zůstane motilita a vitalita spermií zachována pouze několik hodin. Aby se zabránilo časnému vyčerpání a prodloužilo se přežití spermií, musí být jeho metabolická aktivita snížena chemickými inhibitory a/nebo snížením teploty, a proto je nutné ejakulát krátce po odběru naředit. Ve srovnání se spermatem jiných druhů zvířat jsou kančí spermie velmi citlivé na teploty pod 12 °C kvůli nižšímu podílu PUFA v jejich membránách. Teplota ejakulátu v okamžiku odběru je přibližně 37 °C a v místě zpracování (laboratoř) je jeho teplota asi 32–35 °C. Většina inseminačních stanic používá dvoustupňové ředění, ve kterém je sperma nejprve naředěno (1:1) předehřátým ředidlem (cca 33 °C) a následně doředěno ředidlem buď předehřátým nebo udržovaným při pokojové teplotě.
Četné studie se zabývaly vlivem rozdílných teplot, tj. 33 °C vs. 21 °C (pokojová teplota), při ředění spermatu. Ačkoli in vitro nebyl zjištěn žádný zjevný účinek teploty ředění na kvalitu spermatu, jsou nutné studie in vivo, aby se potvrdilo, že spermie ředěné při různých teplotách neztrácejí schopnost oplodnit vajíčka. Protokoly ředění a teplota ředidel se však liší mezi stanicemi.
Nadto, poměr ředění má významný vliv na kvalitu spermií během skladování. Vysoké ředění (0,5 až 1x109spermií/80 ml) má za následek nižší pohyblivost spermií v průběhu skladování ve srovnání s nižším ředění (2,5x109 spermií/80 ml), ale přidání semenné plazmy zmírňuje tento negativní účinek.
 |
| Existuje mnoho druhů ředidel kančího spermatu (foto Maite Santonja) |
Ředidla
Ředidla používaná pro skladování spermatu prodlužují přežitelnost spermií poskytnutím energie, tlumením pH a zabráněním růstu bakterií. K dispozici je mnoho druhů různých ředidel spermatu pro krátkodobé nebo dlouhodobé skladování. Dlouhodobá ředidla obsahují kromě bikarbonátového pufrovacího systému složitější pufrovací systémy (HEPES, Tris) a také obsahují hovězí sérový albumin. Ten má pozitivní vliv na přežití spermií díky absorpci metabolických bakteriálních produktů z ředidla. Podle studií in vitro a in vivo poskytuje většina ředidel na trhu přijatelnou ochranu vitality spermií během prvních 72 hodin skladování, i když pokud je sperma skladováno déle než 4 dny snižuje se pohyblivost a plodnost spermií.
Koncentráty ředidel se obvykle ředí v destilované nebo deionizované vodě. Důležitá je nejen mikrobiologická kvalita vody, ale také obsah elektrolytu, zejména nepřítomnost iontů vápníku. Nedávno bylo prokázáno, že zmagnetizovaná voda zlepšuje integritu membrány spermií snížením peroxidace. Magnetizace vody snižuje hladinu volných radikálů a reaktivních forem kyslíku. Příznivé účinky magnetizované vody však byly pozorovány pouze u vzorků skladovaných po dobu 120 nebo 168 hodin, zatímco dávky spermatu se obvykle používají do 72 hodin.
Předmětem výzkumu byly hormonální doplňky inseminačních dávek ke zlepšení plodnosti. Přidání oxytocinu do dávek zlepšilo porodnost během letních měsíců. Další studie ukázala, že přidání estrogenů, prostaglandinu (PGF2α) a oxytocinu do dávek nezvýšilo zabřezávání, ale zvýšilo celkový počet plodů. Po přidání PGF2αdo spermatu nebylo pozorováno žádné zlepšení motility spermií. Nezdá se, že by tyto hormony měly vliv na kvalitu spermií. Jejich vliv na plodnost prasnic je obtížné určit vzhledem k mnoha faktorům přispívajícím k reprodukčním výkonům.
Antibiotika se běžně přidávají do spermatu, aby se zabránilo nadměrnému růstu bakterií a snížil se účinek bakteriálních toxinů. V kontextu obezřetného používání antimikrobiálních látek může menší používání antibiotik ve zředěném spermatu pomoci snížit antimikrobiální rezistenci. Například jednovrstvá centrifugace spermatu může snížit koncentraci bakterií a následně snížit potřebu antibiotik v ředidlech.
 |
| Moderní hi-tech laboratoř firmy Klasse AI |
Bakteriální kontaminace
Je známo, že bakteriální kontaminace snižuje kvalitu spermatu, jelikož způsobuje aglutinaci spermií a snižuje jejich motilitu. Může také snížit životnost spermií během skladování a jejich potenciál plodnosti. V čerstvém spermatu a stejně tak v inseminačních dávkách se vyskytuje mnoho druhů různých bakterií. Běžně izolované bakterie ze spermatu a jejich vliv na kvalitu spermií shrnuje tabulka 2.
Tabulka 2. Procento kontaminovaných vzorků ředěného spermatu, ve kterých byly izolovány různé bakterie a jejich vliv na kvalitu spermií. Procento se vztahuje k celkovému množství kontaminovaných vzorků.
| Bakterie | Althouse a Lu (2005) | Úbeda a kol. (2010) | Schulze a kol. (2015) | Účinek na spermie |
| % kontaminovaných vzorků (n/celkový počet vzorků) | 31,2 % (78/250) | 14,7 % (263/1785) | 25,6 % (88/344) | snížená kvalita spermií |
| Achromobacter xylosoxidans | 10,3 % | - | 3,4 % | aglutinace, špatná pohyblivost, poškozené akrozomy, kyselé pH |
| Burkholderia cepacia | 2,6 % | - | - | aglutinace, špatná pohyblivost, poškozené akrozomy, kyselé pH |
| Clostridium perfringens | - | - | - | špatná životaschopnost a motilita spermií |
| Enterobacter cloacae | 2,6 % | - | 13,6 % | aglutinace, špatná pohyblivost, poškozené akrozomy, kyselé pH, snížení osmotické rezistence |
| Enterococcus spp. | 20,5 % | - | 8 % | snížená kvalita spermií |
| Escherichia coli | 6,4 % | 1,5 % | - | aglutinace, špatná pohyblivost, poškozené akrozomy |
| Klebsiella spp. | 3,8 % | 11,8 % | 8 % | špatná pohyblivost |
| Leifsonia aquatic | - | - | 20,5 % | snížená kvalita spermií |
| Morganella morganii | - | 3,8 % | - | špatná pohyblivost, poškození akrozomu, snížení osmotické rezistence |
| Proteus mirabilis | 1,3 % | 1,9 % | 5,7 % | špatná pohyblivost, abnormální formy |
| Providencia spp. | 3,8 % | 9,1 % | - | snížená kvalita spermií |
| Pseudomonas spp. | 6,4 % | - | 5,7 % | snížení celkové a progresivní pohyblivosti spermií, životaschopnosti spermií a integrity akrozomu |
| Ralstonia pickettii | - | - | 11,4 % | snížená kvalita spermií |
| Stenotrophomonas maltophilia | 15,4 % | - | - | aglutinace, špatná pohyblivost, poškozené akrozomy |
| Serratia marcescens | 10,3 % | 12,5 % | 2,3 % | aglutinace, špatná pohyblivost, poškozené akrozomy, kyselé pH |
Přesné interakce různých bakterií se spermatem ještě nejsou plně prozkoumány. Rizikovými faktory pro bakteriální kontaminaci během odběru jsou: preputiální tekutina stékající z ruky technika, odběr delší než 7 minut a dlouhé předkožky u kanců. Zkoumány byly též kritické body při zpracování spermatu v laboratoři. Bylo zjištěno, že velká část kontaminace spermatu pochází z laboratorního prostředí, nikoli od kance. Kontrola a zajištění správné hygienické praxe v těchto kritických bodech je nutné pro nižší počet bakterií a lepší kvalitu spermií.
Balení a skladování
Zředěné sperma se balí do 80–100 ml dávek, které se uloží a distribuují. Dávky obvykle obsahují 2–3 miliardy spermií. V posledních letech však byly vyvinuty nové techniky (např. inseminace uvnitř dělohy), které umožňují používat méně spermií v menším objemu.
Balicí proces je prováděn automatizovanými systémy ve většině inseminačních center. Tyto systémy jsou rychlé, přesné a nepoškozují spermie. Pro skladování, dodávku a inseminaci dávek spermatu lze použít různé nádoby, jako jsou plastové lahve, blistry, zkumavky nebo skládací membrány s integrovaným katétrem. Ukázalo se, že typ nádoby ovlivňuje rychlost ochlazování a zdá se, že vaky potřebují méně času k dosažení 17 °C než trubice.
Nejdůležitější pro život spermií při transportu je teplota. Optimální teplotní rozsah pro uchování dávek spermatu je 15–19°C. Za těchto podmínek je metabolická aktivita spermií snížena na bazální úroveň, aniž by došlo ke změně integrity buněčné membrány a různých organel. Konstantní teplotu je nezbytné udržovat nejen během přepravy, ale i ve skladovací jednotce na farmě a co nejvíce se vyhýbat jejímu kolísání. Stejně tak je třeba se vyhnout kontaktu spermií se vzduchem během skladování, protože zvyšuje pH, které negativně koreluje s motilitou spermií.
Souhrn
Vysoká frekvence odběru negativně ovlivňuje kvalitu spermií. Pokud není odběr prováděn hygienicky, zvyšuje se bakteriální kontaminace spermatu. Během zpracování je kančí sperma podrobeno mnoha stresovým faktorům, které mohou snížit jejich potenciál plodnosti. Rychlost a teplota ředění ovlivňují kvalitu dávek spermatu. Některé obaly mohou konzervovat sperma lépe než jiné a některé plastové součásti mohou být toxické pro spermie. Jelikož protokoly ředění a zpracování spermatu se liší mezi stanicemi, je zapotřebí zavedení standardizovaných systémů kontroly kvality inseminačních dávek kančího spermatu.
